测序样品如何分析、问题如何解决
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今天主要对测序中经常遇到的问题进行总结并提出解决方法 ，同时对测序样品的要求作出分析 ，帮助我们在测序前对样品做好准备 ，并在失败的结果中找到解决方法。 测序样品分析 1. 测序的样品可以有 PCR 产物 ，菌 (新鲜菌液、穿刺菌、平板菌、甘油菌 ) ，质粒。测序提供的样品最基本的原则就是要保证样品的量和纯度。 2. PCR 产物测序 ，PCR 产物测序的第一要素是 PCR 产物的纯度 ，如果是 PCR 产物原液 ，则需要经过琼脂糖凝胶电泳纯化后再进行测序 ，如果不经过电泳产物回收纯化这一步 ，测序容易出现乱峰或叠峰 ，如果是已 经纯化好的 PCR 产物 ，可直接测序。第二要素是引物 ，引物必须经过纯化 ，纯度至少大于 90%。 3. 菌液测序 ，需提供足量的新鲜的菌液 ，新鲜菌液成功率较高 ，测序公司可以直接提取质粒测序。 4. 菌体可以是多种形式平板菌、穿刺菌。两者都是在含有抗生素的固体培养基中 ，可用肉眼观察到菌落并保证无杂菌污染。 5. 质粒测序要提供一定浓度和量 ，注明名称 ，酶切位点及片段大小。此外 ，小于 100bp 片段一般是先克隆再测序 ，直接测序较难得到结果。 免费送！IVD研发3000+++配方等 测序问题与解决 1.测序信号衰减/中断 测序信号衰减或中断是测序过程中的常见问题 ，原因多种多样 ：模板中含有重复序列 ，或是模板含有高级结构所致 ， 模板中 GC 含量过高等都有可能使测序信号衰减 ，此外 ，引物的质量 ，试剂失活也有可能造成此现象。解决方法 ：采用反向引物测序 ，通过序列拼接获得全长 ，过程中可适当的加入 DMSO ，并使用高级试剂盒扩增。 2.测序出现重叠峰/乱峰 测序中间出现重叠峰(双峰) ，是因为序列前面有连续的碱基出现 ，或是测序引物碱基缺失。如果一直出现重叠峰 ，就是序列本身有非特异性条带 ，非特异性条带的话就要从PCR 扩增开始分析 ，注意提高PCR 扩增的特异性 ，扩增可以选择高特异性的 Taq 酶(如热启动酶) ，能够大大的降低错配 ，提高扩增序列的特异性。也可以做 TA 克隆 ，采用单克隆测序。测序的引物 ，最好自己提供 ，保证引物的特异性并防止降解 (不要选择通用引物) ，同时表明测序结果提供序列全长。 3.poly 结构测序结果乱峰/衰减/中断 Poly ( A/T/C/G ) 结构的测序易出现移码现象并导致测序信号衰减中断 ，这是因为序列中有连续的碱基出现所致 ， 建议采用反向引物测序获得全长。 4.测序结果为空载体 2023年核心十六份IVD报告！目的片段插入失败 (提供的克隆为阳性克隆) 或培养过程中目的片段丢失 ，只要重新挑取单克隆 ，进行 PCR 后送 去测序即可。 5.测序引物 测序引物要求较高 ，理论上可以用 PCR 扩增时的引物测序 ，但不能测得全长 ，当测序完成时 ，可以从中间设计引 物反向测一个 ，这样便能得到序列全长。测序的引物 3’端要和模板完全配对 ，长度 16-22bp 左右 ，GC 含量 50% 左右 ，测序引物纯度有很高要求 ，必须经过纯化且纯度至少大于 90%。
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