qPCR 实战经验分享，让你少走弯路！
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qPCR实验中出现“十跑九跪”的情况，通常意味着实验的重复性和可靠性较差。可以自己分析下原因，这可能是由以下几个原因造成的： 1加样操作不当：加样时的不准确可能导致实验结果的波动。这包括移液枪的准确性和加样时的技术，如果操作不当，即使是微小的误差也会导致实验结果的不稳定。吸取液体的时候，需要把枪头插入凹液面下面，而不是插到凹液面的侧面。侧面比较容易产生气泡，每次枪头不能插很深，不然，就很容易在枪头上沾上液滴，在微量的模板加样时，很容易导致加样量的误差。这个操作熟能生巧，新手们要淡定，加多了就又快又好了。 2 预混液混合不均：qPCR预混液如果没有混合均匀，也会影响实验的重复性。确保预混液在使用前充分震荡混匀是非常重要的步骤。提前排版，采取大体积配置试剂预混 Mix 溶液，可以增加复孔的重复度，减小误差。一般会多配一些样品，这样保证最后每个孔都能有同等体积的液体；预混后要涡旋离心，使其混匀。 3 模板DNA质量问题：模板DNA的质量和纯度直接影响qPCR的效率和特异性。如果模板DNA含有抑制剂或浓度不准确，都可能导致实验失败。 cDNA 模板需要稀释吗?应该稀释多少倍进行定量? 没有具体的稀释参考倍数，理论上 cDNA 每稀释 10 倍 CT 值变大 3.3，可以根据这个规律进行合适的稀释。可以使用 cDNA 原液、10 倍稀释液、100 倍稀释液等梯度稀释模板进行定量实验，根据规律选择 CT 值落在 18~28 范围内的稀释倍数。 4 引物设计和优化：引物的设计和优化是实验成功的关键。不合适的引物可能会导致非特异性扩增或扩增效率低，影响实验结果的准确性。可以翻看下之前的引物设计篇，有详细的设计注意事项，引物设计 Primer Premier5操作详细过程-干货分享 分分钟学会 5 荧光染料或探针的选择：荧光染料或探针的选择不当也会影响实验的灵敏度和特异性。上机前，检测下孔内是否有气泡，若存在气泡需轻轻弹去，不要在管口对准的管盖部分做标记，影响荧光信号采集。
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