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手把手教你,流式实体组织样本制备

 流式细胞术包含几个重要环节,包括:①单细胞悬液样品的制备、②选择合适的抗体并染色、③上机操作、④数据分析。每个步骤都很重要,直接决定了是否能获得满意的流式结果。
动物组织制备单细胞悬液时,有的使用了消化液方案,有的并不需要,视组织分离难易而定,本文介绍小鼠脾脏无消化液方案制备单细胞悬液。
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1. 取材:安乐死小鼠并取出脾脏,将脾脏放入培养皿中,并加入1mLPBS缓冲液。
注意:
1)流式一般要求染色前为活细胞(部分染色需要破膜、固定操作,此时细胞就变成死细胞了),因此取出的动物组织不可放入液氮中。
2) 带有少量脂肪组织问题不大,因为脂肪组织不好研磨,后续会通过细胞筛将其过滤掉。

3) 取材前不需要血液灌流,因为后续有裂红步骤。

2. 研磨:用无菌注射器柄轻轻研磨组织。
注意:研磨至无明显组织块即可,不可过度研磨,避免加重细胞损伤。

3. 吹散、过滤细胞:额外加入约 5mL PBS 缓冲液至培养皿中,轻轻吹散细胞,随后用70um细胞筛进行过滤。
过滤完毕后,再用5mL PBS 冲洗培养皿,并过滤冲洗细胞筛(为了尽可能多地收集细胞)。

4. 离心:常温离心弃上清获得细胞团。离心参数:300g,5min。

5.裂红:加入1X红细胞裂解液2mL重悬(若为10X裂解液,则需要现配现用稀释至1X)。常温裂解2min,2min后加入6-8mL PBS终止裂解。

▲图为裂红后呈现的淡红色浑浊液

6.离心弃裂红液,保留底部细胞团,离心参数同上:300g,5min。

7. 重悬获得单细胞悬液:用2~3mL PBS 或细胞染色缓冲液(Cell Staining Buffer )重悬为单细胞悬液。
注意:有条件推荐使用细胞染色缓冲液,其主要成份为:磷酸盐缓冲液(PBS), 叠氮钠(NaN3)和胎牛血清(FBS)等。
FBS 作为一种蛋白存在于缓冲液中可以减少抗体的非特异性结合,叠氮钠可以维持细胞表面抗原的稳定性。部分 Cell Staining Buffer 里还含有EDTA,可以减少细胞成团,尽可能保持单细胞悬液状态。

8. 细胞计数:此前步骤已将单细胞悬液制备完成,要求严格的,特别是初次实验时,还需要进行细胞计数。控制细胞数量在 1x10^7 / mL 为宜,这样取 100μL 样本时,细胞总数便达到 1x10^6 了。

注意:
1)流式细胞术每管样品收集多少个细胞数并不固定,一般情况下,如果是细胞系样本的,收集5000个就够了,如果是动物组织样本的,最好收集100万个,也就是 1x10^6 。
原因是组织样本细胞成份多(不只是一种细胞),并且在制备样本过程中,死细胞产生的细胞碎片也比较多。

▲图片来源网络

9. 避光、分管染色:按实验要求分管染色,每管一般取 100μL 单细胞悬液进行染色。
注意:
1)取 100μL 进行染色是为了避免细胞悬液太多而浪费流式荧光抗体;
2)根据抗体说明书的染色时间进行避光染色,此时不同抗体一般染色时间是不一样的,染多个颜色的时候,可以直接以染色时间最长的抗体为准。
10. 染色完毕,离心弃染色浮液:参数同上。
11. 用 PBS 或 Cell Staining Buffer 200μL 重悬细胞,尽快上机操作。
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安全提示⚠️:
若使用细胞染色缓冲液(Cell Staining Buffer)进行实验,因其含有叠氮钠(有毒物质),请注意防护,避免与皮肤、眼睛和黏膜的接触。

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