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手把手教你，流式实体组织样本制备

2024-4-2 17:16:27

流式细胞术包含几个重要环节，包括：①单细胞悬液样品的制备、②选择合适的抗体并染色、③上机操作、④数据分析。每个步骤都很重要，直接决定了是否能获得满意的流式结果。
动物组织制备单细胞悬液时，有的使用了消化液方案，有的并不需要，视组织分离难易而定，本文介绍小鼠脾脏无消化液方案制备单细胞悬液。
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1. 取材：安乐死小鼠并取出脾脏，将脾脏放入培养皿中，并加入1mLPBS缓冲液。
注意：
1）流式一般要求染色前为活细胞（部分染色需要破膜、固定操作，此时细胞就变成死细胞了），因此取出的动物组织不可放入液氮中。
2) 带有少量脂肪组织问题不大，因为脂肪组织不好研磨，后续会通过细胞筛将其过滤掉。

3) 取材前不需要血液灌流，因为后续有裂红步骤。

2. 研磨：用无菌注射器柄轻轻研磨组织。
注意：研磨至无明显组织块即可，不可过度研磨，避免加重细胞损伤。

3. 吹散、过滤细胞：额外加入约 5mL PBS 缓冲液至培养皿中，轻轻吹散细胞，随后用70um细胞筛进行过滤。
过滤完毕后，再用5mL PBS 冲洗培养皿，并过滤冲洗细胞筛（为了尽可能多地收集细胞）。

4. 离心：常温离心弃上清获得细胞团。离心参数：300g，5min。

5.裂红：加入1X红细胞裂解液2mL重悬（若为10X裂解液，则需要现配现用稀释至1X）。常温裂解2min，2min后加入6-8mL PBS终止裂解。

▲图为裂红后呈现的淡红色浑浊液

6.离心弃裂红液，保留底部细胞团，离心参数同上：300g，5min。

7. 重悬获得单细胞悬液：用2~3mL PBS 或细胞染色缓冲液（Cell Staining Buffer ）重悬为单细胞悬液。
注意：有条件推荐使用细胞染色缓冲液，其主要成份为：磷酸盐缓冲液（PBS），叠氮钠（NaN3）和胎牛血清（FBS）等。
FBS 作为一种蛋白存在于缓冲液中可以减少抗体的非特异性结合，叠氮钠可以维持细胞表面抗原的稳定性。部分 Cell Staining Buffer 里还含有EDTA，可以减少细胞成团，尽可能保持单细胞悬液状态。

8. 细胞计数：此前步骤已将单细胞悬液制备完成，要求严格的，特别是初次实验时，还需要进行细胞计数。控制细胞数量在 1x10^7 / mL 为宜，这样取 100μL 样本时，细胞总数便达到 1x10^6 了。

注意：
1）流式细胞术每管样品收集多少个细胞数并不固定，一般情况下，如果是细胞系样本的，收集5000个就够了，如果是动物组织样本的，最好收集100万个，也就是 1x10^6 。
原因是组织样本细胞成份多（不只是一种细胞），并且在制备样本过程中，死细胞产生的细胞碎片也比较多。

▲图片来源网络

9. 避光、分管染色：按实验要求分管染色，每管一般取 100μL 单细胞悬液进行染色。
注意：
1）取 100μL 进行染色是为了避免细胞悬液太多而浪费流式荧光抗体；
2）根据抗体说明书的染色时间进行避光染色，此时不同抗体一般染色时间是不一样的，染多个颜色的时候，可以直接以染色时间最长的抗体为准。
10. 染色完毕，离心弃染色浮液：参数同上。
11. 用 PBS 或 Cell Staining Buffer 200μL 重悬细胞，尽快上机操作。
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安全提示⚠️：
若使用细胞染色缓冲液（Cell Staining Buffer）进行实验，因其含有叠氮钠（有毒物质），请注意防护，避免与皮肤、眼睛和黏膜的接触。

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