DNA聚合酶介绍及荧光定量PCR中Taq DNA聚合酶的选择
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前言
每种生物体都有DNA聚合酶，它们在体内执行DNA复制、DNA重组、DNA损伤修复的功能，维持遗传物质的传递和稳定。DNA聚合酶是进化上高度保守的功能蛋白，根据系统发生分析及蛋白序列的相似性，DNA聚合酶可分为7个家族：A、B、C、D、X、Y和RT。DNA聚合酶是一种多功能酶，主要包含3种酶活性：5'-3' 的DNA 聚合酶活性、5'-3' 核酸外切酶活性、以及3'-5' 核酸外切酶活性。
Taq酶空间结构示意图
DNA聚合酶的特性主要由下面5个参数来描述和定量： 1)酶的热稳定性(Thermostability)：PCR 扩增依赖于热稳定的聚合酶，确保在PCR 循环相关的操作温度范围内聚合酶仍然保持足够的活性。一般采用特定温度处理下，仍然保持50%聚合酶活性的时间来描述。 2)酶合成的特异性(Specificity)：DNA 聚合酶扩增特定目标序列的能力，受 DNA 聚合酶的活性影响。 3)酶的持续合成能力(Processivity)：描述聚合酶的合成效率，聚合酶每次与模板结合期间可以掺入的核苷酸数量定义，一次结合掺入的核苷酸越多，酶的合成效率越高。 4)酶的链延申速度(Extension rate)：聚合酶催化DNA延伸的速度，用核苷酸/秒或千碱基 (kb)/分钟来描述。 5)酶的保真性(Fidelity)：描述聚合酶在 PCR 过程中新合成 DNA 序列时插入正确核苷酸的能力。 此外，还有一些参数用来描述DNA聚合酶的其他特性，如酶的链置换活性、酶对等位基因的鉴别能力、酶对抑制物的耐受性、酶的皮实性、酶对修饰核苷酸的选择性等。 每种 DNA 聚合酶因为酶特性上的差异，都有自己独特的应用领域，如高保真 PCR、定量 PCR、测序、等位基因特异的PCR扩增等。不同来源的DNA聚合酶在序列上的差异，赋予了不同的DNA聚合酶在酶的热稳定性、扩增速度、扩增的保真性、底物选择性等方面不同的特性。在PCR反应中应用最广泛的是来源于家族A的Taq DNA聚合酶，以及来源于家族B的Pfu DNA聚合酶。前者由于扩增效率高而广泛用于常规PCR及分子诊断，后者由于具有高保真性，广泛应用分子克隆。
DNA聚合酶的聚合活性中心进一步细分为手指(Finger)、手掌(Palm) 和 拇指(Thumb)亚结构域。酶对DNA的聚合反应是一个非常复杂的过程，需要酶不同亚结构域协同完成。首先，DNA 聚合酶的拇指结构域以高亲和力与模板和引物的杂交双链的引物3’连接点结合。其次，聚合酶-DNA的复合物的手指亚结构域结合脱氧核苷三磷酸 (dNTP)，与模板单链上相邻碱基互补的dNTP结合的亲和力更大，优先结合。最后，聚合酶通过催化dNTP与引物的 3' 端形成磷酸二酯健，从而将链延伸一个核苷酸。链延申反应过程中聚合酶的构象变化起着至关重要的作用：dNTP与聚合酶-DNA 复合物结合时，手指亚结构域处于打开状态，当与模板互补的dNTP结合后，手指亚结构域构象变成关闭状态，使结合的dNTP与酶促活性位点紧密结合，并催化核苷酸合成到引物末端。然后，手指亚结构域构象再次变成打开状态，聚合酶向前滑动到模板链中的下一个核苷酸位置，开始下一个dNTP合成循环。对于不与模板互补的dNTP结合，手指亚结构域构象只发生轻微改变，有利于错配dNTP的解离，互补dNTP的重新结合，从而保证新合成链保真度。
DNA聚合酶聚合反应示意图
天然的DNA聚合酶在细胞内的反应环境与PCR有很大的不同。DNA复制和修复是一个非常复杂的酶促反应过程，在胞内，存在多种DNA聚合酶，分别完成不同的细胞功能。DNA聚合酶还通过多种蛋白的协同作用来完成DNA的复制和修复，而且主要是通过多亚基的DNA聚合酶来进行高效率的DNA复制。而当DNA聚合酶用于PCR反应时，一般是采用简单的单一多肽链的DNA聚合酶，因而任何一种酶都难以完美地满足PCR的对酶的所有期待，如酶的热稳定性、保真性、以及链延申速度等。而且酶的一些特性是相互制约的，比如高保真酶由于具有3'-5' 核酸外切酶活性，导致其扩增效率偏低。因而需要根据不同的应用需求对酶进行改造，强化和突出某些特定的酶特性。目前商品化的DNA聚合酶大都是针对不同的应用需求，通过定向进化从天然酶中改造而来。
DNA聚合酶示意图 对DNA聚合酶的修饰和改造就是基于对DNA聚合酶的结构分析，以及对不同来源、具有不同特性的DNA聚合酶的序列比较等知识而进行的。修饰和改造具有新特性的聚合酶的策略包括基于已有知识的定点诱变、或随机突变后的定向筛选、其它蛋白与酶蛋白的融合，以及不同来源酶蛋白片段的重新组合等。分区化自我复制(Compartmentalized Self Replication)是突变酶高通量筛选的强有力方法，通过几轮对突变库的酶定向筛选，很快就能获得某种性能提高的突变酶，比如具有更快聚合速度、更强的耐抑制物等特性。DNA聚合酶持续合成能力的高低与聚合酶-DNA复合体的亲和力密切相关，因而通过改变与DNA结合位点的聚合酶的氨基酸，通常是突变为带正电荷的氨基酸可以增加结合亲和力。另一个途径是将DNA聚合酶与一个耐热的DNA结合蛋白融合，也可以大大增加酶与DNA结合的亲和力，同时还能提高酶的热稳定性。通过二种不同来源的DNA聚合酶的同源片段的重新组合，也能获得兼具二种酶特性的嵌合酶。
Taq DNA聚合酶是第一个分离得到的耐热DNA聚合酶，来源于噬热细菌栖热水生菌（Thermus aquaticus）。每位从事生命科学相关的工作者估计都使用过，至少知道Taq DNA聚合酶。Taq 的分子量为 94 kDa，分为2个功能域，在其N 端具有5'-3' 核酸外切酶活性，在其 C 端具有5'-3' 的DNA 聚合酶活性。Taq DNA聚合酶由于其相对具有较高的耐热性和扩增效率等优点，一直是大多数 PCR反应的首选酶。随着荧光定量PCR技术的发展，Taq酶固有的 5'-3' 核酸外切酶活性可以水解与扩增产物杂交的荧光标记探针，意味着 PCR 扩增的积累可以与目标特异性荧光探针的信号释放同时实现，并且累积的荧光信号与扩增产物的量密切相关。这使得Taq DNA聚合酶是采用Taqman探针的荧光定量PCR技术的不二选择，广泛用于病原体检测、SNP 基因分型和基因表达分析等分子诊断领域。
Taq DNA聚合酶因其优越的性能而广泛应用于PCR扩增，特别是基于荧光定量PCR技术的分子诊断领域。但随着对荧光定量PCR检测的灵敏度、特异性、以及检测速度的要求日益提高，特别是分子及时检测（POCT）快速发展，对DNA聚合酶提出了更高的要求。Taq DNA聚合酶的某些性能缺陷变得更加突出，需要进一步提高和改进。如Taq DNA聚合酶活性的半衰期在 95℃时为 40 分钟，但在 97.5℃时迅速降至仅9分钟。因此，在 95℃进行变性步骤可能会使Taq DNA聚合酶部分变性，特别是在仪器控温系统不是很精准的情况下，这一问题更加突出，酶活性随着PCR循环数增加快速下降。另外，Taq DNA聚合酶的链延申速度虽然在最佳反应条件下可达到每秒150碱基，但是酶反应速度受PCR反应体系、模板序列、以及延申温度等多重因素的影响。一般通过优化反应条件，PCR扩增效率可达到Taq DNA聚合酶80%的扩增效率。而在通用的二步法荧光定量PCR条件下，链延申温度为60℃，此条件下酶活性约只有最佳活性的50%。 另外，Taq DNA聚合酶在室温时，虽然聚合酶活性降低，但仍然具有一定的聚合酶活性，容易引起非特异性扩增。Taq DNA聚合酶对于抑制物的耐受性较低，而不同来源的模板可能含有特定的抑制物，因而对模板纯度要求较高。 由于Taq DNA聚合酶在PCR中的重要性，针对Taq DNA聚合酶的改造一直伴随着PCR技术的发展，性能优异的Taq DNA聚合酶不断推出。通过对Taq DNA聚合酶的各种改造，成功获得了在基本保留Taq DNA聚合酶其它特性的基础上，另外某些特性增强或获得的Taq DNA聚合酶，如耐热性提高、扩增速度提高、抗抑制物耐受性提高、具有热启动效果的酶、具有逆转录活性酶、具有修饰核苷酸掺入活性的酶等，以满足不同的应用需求。
针对基于探针的荧光定量PCR扩增，目前市面上销售的Taq DNA聚合酶的品牌众多，包括跨国公司和本土产品。由于不同公司的Taq DNA聚合酶基本都包含不对外公布的修饰和改造，这些酶在性能上会存在一定的差异，不同的酶在一些特定的性能指标上可能表现的更加优越。并且这些酶基本上都是在主流的常规PCR仪器上进行的优化，因而，在常规PCR仪器上开发一个特定病原体的荧光定量PCR扩增试剂，比较容易筛选到一款适合的Taq DNA聚合酶，很多国产品牌的酶都达到了非常优越的检测性能。 但是针对分子POCT产品开发，情况就完全不一样。由于基于荧光定量PCR扩增的POCT仪器本身的属性，仪器设计要满足小巧便携，样本处理、扩增和检测一体化整合，还要检测速度快捷等性能。目前市场上基于荧光定量PCR扩增的POCT仪器与常规荧光定量PCR仪器存在很大的差异，POCT仪器还在产品开发的早期，无论是在实现原理、还是设计制造上都是八仙过海、各显神通，远没有实现标准化，使得不同品牌的分子POCT仪器大都是一款特异性产品，往往需要配套一次性芯片及预装的试剂。 因此，分子POCT检测对Taq DNA聚合酶的要求也更高，需要酶有更快的反应速度、更高的耐热性及常温储存稳定性、以及对抑制物更高的耐受性等性能指标。很多在常规荧光定量PCR仪上表现优越的Taq DNA聚合酶在POCT仪器上，扩增效果就差强人意。如果再采用快速扩增程序，问题更大，轻者灵敏度显著下降，重者扩增完全失败。由于分子POCT仪器的差异，使得Taq DNA聚合酶的普适性显著下降，对于一款特定的分子POCT仪器，往往需要广泛筛选Taq DNA聚合酶，才有可能找到一款或几款合适的Taq DNA聚合酶。并且还需要在此基础上，针对特定检测靶点，对筛选出来的酶及反应体系再进行系统优化。此外，还需要考虑Taq DNA聚合酶与其它试剂在芯片上冻干或风干后的稳定性。
PCR技术在分子生物学领域的应用不断增长，也推进了对DNA聚合酶性能的持续改进。随着新型的DNA聚合酶的不断发现、以及对现有酶的定向进化改造，相信在未来，具有更高合成能力的 DNA 聚合酶还会不断出现，以满足PCR扩增更高灵敏度、特异性以及更快检测速度的要求。 文章转载自公众号：任博士和他的小伙伴们，作者：张博士 |
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