细胞培养技术(细胞传代实验)
原理 培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代,部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代,悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代,或用自然沉降法吸除上清后,再吹打传代。 材料与仪器 器材: 净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱 倒置相差显微镜、培养箱、吸管 玻璃瓶、培养瓶、废液缸、吸头、枪头 胶塞、离心管、加样枪、红血球计数板 试剂: 细胞 D-Hanks 液、小牛血清、RPMI1640 双抗、胰蛋白酶、EDTA、NHCl NaHCO3 步骤 1. 贴壁细胞的消化法传代: (1)吸除或倒掉瓶内旧培养液; (2)D-Hanks 液洗 2~3 次; (3)向瓶内加入适量消化液(胰蛋白酶或与 EDTA 混合液)轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍所有细胞表面; (4)然后吸掉或倒掉消化液后再加适量新的消化液,轻轻摇动再倒掉大部分消化液,仅留少许进行消化(也可不采用上述步骤直接加消化液进行消化); (5)消化最好在 37 ℃ 或室温 25 ℃ 以上环境下进行; (6)消化 2~5 min 后把培养瓶放置显微镜下进行观察,发现胞质回缩,细胞间隙增大后,应立即终止消化; (7)吸除或倒掉消化液,如用 EDTA 消化,需加 Hanks 液数毫升,轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉; (8)再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液,终止消化; (9)用弯头吸管,吸取瓶内培养液,反复吹打瓶壁细胞,吹打过程要顺序进行; (10)从培养瓶底部一边开始到另一边结束,以确保所有底部都被吹到,使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔不要用力过猛; (11)计数,分别接种在新的培养瓶内; 2. 悬浮细胞的传代: 悬浮细胞传代可离心收集细胞后传代,或直接传代;离心传代法: (1)将细胞连同培养液一并转移到 15 ml 离心管内; (2)离心 800~1000 rpm,5 min; (3)弃去上清,加新的培养液到离心管内,用吸管吹打形成细胞悬液; (4)计数,分别接种在新的培养瓶内; (5)直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后,将上清液吸掉 1/2~2/3 ,然后用吸管吹打形成细胞悬液后再传代。 3. 部分贴壁细胞的传代 (1)部分贴壁不牢的细胞,如 Hela 细胞等,不经消化处理直接吹打可使细胞从壁上脱落下来,而进行传代。 (2)对绝大部分贴壁生长的细胞,因直接吹打对细胞损伤较大,细胞常有较大数量的丢失,因而需消化后,才能吹打传代。 注意事项 (1) 胰蛋白酶要预温,温度 37 ℃ 左右为宜。 (2) 离心转速要合适,转速过低,不能有效分离细胞,离心速度过大,时间过长,会挤压细胞造成损伤甚至死亡。 (3) 要定时观察细胞,发现污染,应及时处理。 常见问题 根据细胞生长的恃点,传代方法有 3 种:悬浮生长细胞传代、半悬浮生长细胞传代(Hela细胞)、贴壁生长细胞传代。 培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代;部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代;悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代,或用自然沉降法吸除上清后,再吹打传代。 |
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